Фракционные радиочастотные системы с микроиглами являются популярным средством повышения эластичности стареющей кожи. Лазерная доставка лекарств — это многообещающий метод эпидермальной инъекции лекарств и косметических ингредиентов, применяемых местно. В этом исследовании оценивается безопасность и эффективность местной доставки L-аскорбиновой кислоты, витамина Е и феруловой кислоты после фракционной радиочастотной обработки с помощью микроигл для уменьшения фотоповреждений.
В этом проспективном одноцентровом контролируемом пилотном исследовании с разделенным лицом шесть женщин (средний возраст 48, 0 лет; диапазон от 35 до 57 лет; типы кожи по Фитцпатрику III и IV) с легким или умеренным фотоповреждением прошли один сеанс фракционного микронидлинга. Пациентам было рекомендовано наносить антиоксидантный состав только на одну сторону лица. Пациенты были обследованы через 3 дня, 7 дней и 4 недели после этого с использованием трехмерной визуализации и ультразвука. Ex vivo человеческую кожу на всю толщину использовали для молекулярной и гистологической оценки. Статистический анализ был проведен с помощью t-критерия, U-критерия Манна-Уитни и одностороннего дисперсионного анализа.
По сравнению с необработанной стороной сторона, обработанная антиоксидантами, показала значительное увеличение толщины дермы (10, 32% против 17, 54%, p < 0, 05), но не эластичности кожи (4, 76% против 4, 69%, p> 0, 05). Разница в эритеме между сторонами была статистически недостоверной (p> 0, 05). В модели ex vivo экспрессия FGF2 в коже была значительно увеличена после нанесения антиоксидантного состава по сравнению с результатами, полученными после только фракционной радиочастотной обработки микроиглами (p < 0, 01).
Это исследование демонстрирует, что для лечения фотоповрежденной кожи доставка антиоксидантного препарата с помощью лазера является безопасным и эффективным адъювантным методом после фракционного RF-лифтинга.
Вступление
Ранние признаки старения кожи лица возникают из-за изменений эластичности тканей и деградации коллагена, вызывая образование тонких и глубоких кожных складок. По мере того, как процедуры по омоложению лица становятся все более популярными, все большее распространение получают лазеры и устройства на основе энергии. Высокочастотные переменные электрические токи вызывают неоколлагенез и эластогенез за счет объемного нагрева дермы и подкожной ткани. Монополярные и биполярные радиочастотные системы демонстрируют сопоставимые или даже более высокая эффективность при омоложении лица по сравнению с традиционными абляционными процедурами. Электромагнитное излучение вызывает сокращение и ремоделирование коллагена, приводя к образованию белков теплового шока и матричных металлопротеиназ; это способствует устойчивому эффекту ремоделирования дермы. Системы с фракционными микроиглами RF (FMRF) используются для нанесения микродоз биполярного RF на кожу для создания столбов теплового повреждения. Микроигольчатый электрод, изолированный или неизолированный, напрямую проникает в эпидермис для передачи электромагнитных импульсов, которые вызывают образование микротермических зон (MTZ) денатурированного коллагена.
Лазерная доставка лекарств (LADD) чаще всего выполняется с использованием абляционных фракционных лазеров (AFL), а MTZ могут улучшить пассивное поглощение доставленных молекул за счет увеличения проникновения через кожу. Использование RF-систем может улучшить проникновение через кожу макромолекулы или гидрофильные агенты, аналогичные микропорации, полученной с помощью ультразвука. Гистологически устройства фракционного RF генерируют более поверхностные и более широкие MTZ по сравнению с различными устройствами AFL.
Воздействие УФ-излучения является основной причиной повреждения кожи; это приводит к производству активных форм кислорода (АФК) и активации рецепторов клеточной поверхности, тем самым вызывая воспалительный каскад. Таким образом, антиоксиданты играют существенную роль в предотвращении старения кожи из-за воздействия ультрафиолета. Эндогенные и экзогенные антиоксиданты истощаются при многократном воздействии ультрафиолета. Витамин C, L-аскорбиновая кислота, является гидрофильным антиоксидантом, который действует как поглотитель ROS после воздействия ультрафиолета, и снижает образование клеток солнечного ожога и эритемы. Эффективное чрескожное всасывание L-аскорбиновой кислоты зависит от ее состава и средства доставки при местном нанесении на кожу. Среди различных производных и изоформ липофильная этерифицированная L-аскорбиновая кислота демонстрирует самую высокую склонность к чрескожному всасыванию. Добавление α-токоферола и феруловой кислоты стабилизирует состав и усиливает фотозащиту. Кроме того, L-аскорбиновая кислота участвует в стимуляции биосинтеза коллагена.
Насколько нам известно, проспективных рандомизированных контролируемых клинических испытаний систем FMRF не проводилось. Мы предположили, что местные добавки с антиоксидантами улучшат заживление ран, предоставив основу для восстановления и роста коллагена. Здесь мы сообщаем о клинических результатах пилотного исследования фотостарения лица после местного применения L-аскорбиновой кислоты, витамина E и феруловой кислоты.
Материалы и методы
Дизайн исследования и отбор участников
Это было проспективное одностороннее слепое контролируемое пилотное исследование, проведенное в нашем учреждении с 1 февраля 2019 г. по 31 июня
2019 г. Шесть участниц (средний возраст 48 лет; диапазон 35-57 лет; тип кожи III по Фитцпатрику) и IV) с фотоповреждениями от легкой до умеренной (шкала Глогау 18 ≥ 2) были включены в это исследование, которое было одобрено Экспертным советом нашего учреждения. Субъекты были исключены, если они были моложе 20 лет, старше 60 лет, имели в анамнезе келоидные рубцы, были беременны, имели неконтролируемое заболевание или использовали какие-либо косметические средства, содержащие антиоксидантные компоненты, в течение 6 месяцев до лечения. Пациенты, которые получали материалы для увеличения мягких тканей или неабляционное лазерное лечение в течение шести месяцев до исследования, также были исключены из исследования.
Уход
За час до процедуры были применены местные анестетики (2, 5% лидокаина HCl и 2, 5% крем прилокаина) под окклюзией. Все пациенты прошли лечение всего лица с помощью устройства FMRF импульсного типа с 25 неизолированными микроиглами в матрице 5 × 5. Радиочастотное устройство было настроено на частоту 2 МГц, а глубина проникновения была установлена на 2, 0–2, 4 мм, что эквивалентно 100–150 джоулям энергии, передаваемой при 2 МГц за импульс. Веки и периоральные области не обрабатывались. Сразу после лечения FMRF пациенты были проинструктированы наносить от четырех до пяти капель местного препарата L-аскорбиновой кислоты, витамина Е и феруловой кислоты на одну сторону лица. Сторона лица, на которую будет наноситься состав, была случайным образом обозначена перед экспериментом. Пациентам также предлагалось наносить солнцезащитный крем и увлажняющий крем.
Оценка клинической эффективности и безопасности
Все участники были обследованы через 3 дня, 1 неделю и 4 недели после лечения FMRF. Лечение было завершено через 8 недель после первого посещения. Все цифровые фотографии были сделаны с использованием одних и тех же настроек камеры и подверглись цифровой обработке с использованием идентичных программ обработки изображений. Фотостарение было слепо оценено двумя независимыми врачами (J.H.L и C.E.Y) по 5-балльной глобальной шкале фотостарения (GPS). Для объективной оценки омоложения кожи использовалась система трехмерной (3D) визуализации для измерения длины кривизны средней зоны лица от борозды носа до передней части лица.
Для измерения структурных изменений дермы и подкожной клетчатки, а также для измерения толщины дермы выполняли ультразвуковое сканирование с помощью прибора Ultrascan UC22 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Кельн, Германия). Эластичность кожи оценивали с помощью прибора Cutometer Dual. Устройство MPA 580 (Courage + Khazaka electronic GmbH).
Чтобы оценить побочные эффекты, изменения цвета кожи измеряли как индексы эритемы и меланина с помощью узкополосной спектрофотометрии отражения (DermaSpectrometer II; Cortex Technology, Хадсунд, Дания) с зондами 568 и 655 нм при каждом посещении.
Исследование in vitro
Подготовка кожи ex vivo и обращение с тканями
Остаточные образцы кожи человека женщин в возрасте 35-55 лет были получены в отделении пластической хирургии нашего учреждения, что было одобрено Экспертным советом нашего учреждения. Ткани трижды промывали фосфатно-солевым буфером Дульбекко. Для УФ-облучения каждый образец кожи ex vivo облучали при 4 Дж / см2 лампами УФ-А мощностью 8 Вт (F8T5BL, Sankyo Denki Co., Ltd., Канагава, Япония). Образец кожи на всю толщину был обработан FMRF импульсного типа с теми же параметрами, что и у пациентов (2 МГц, проникновение 2,4 мм). После этого образцы обрабатывали 0,001% L-аскорбиновой кислоты, витамина E и феруловой кислоты. Ткани культивировали в 2% агарозном геле (агароза: среда Игла, модифицированная Дульбекко = 1: 5; Young Sciences, Пучхон, Южная Корея) в инкубаторе при 37 ° C, высокой влажности и 5% CO2.
Количественная ПЦР в реальном времени (qPCR)
Чтобы исследовать потенциальный механизм, участвующий в наблюдаемом эффекте витаминов C, E и феруловой кислоты после лечения FMRF, мы исследовали влияние экспрессии генов на ремоделирование внеклеточного матрикса (ECM) в коже человека ex vivo. Уровни экспрессии мРНК трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β), коллагена III типа (COL3A1) и фактора роста фибробластов (FGF2) были проанализированы с использованием глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) в качестве контрольного гена. Образцы кожи, обработанные FMRF, собирали через 3 и 7 дней после обработки для экстракции РНК. Тотальную РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Plus Mini Kit и обратно транскрибировали в кДНК с использованием набора EcoDry Premix «РНК в кДНК». qPCR проводили с использованием смеси TaqMan Gene Expression Master Mix. Анализы экспрессии генов TaqMan, использованные в этом исследовании, были следующими: Hs00943809_m1 (COL3A1), Hs00171257_m1 (TGFB1), Hs002666454_m1 (GAP1998).
Гистологический анализ
Образцы кожи были взяты на биопсию и зафиксированы в растворе формалина (10%) в течение 24 часов. Блоки парафина разрезали на срезы толщиной 4,5 мкм. Срезы образцов депарафинизировали с использованием серии ксилола и этанола при комнатной температуре, а затем промывали деионизированной водой. Срезы образцов окрашивали гематоксилином и эозином, а также окрашивали трихромом Массона для анализа денатурации и отложения коллагена.
Иммунофлуоресценция
Чтобы оценить потенциальное раздражение, вызванное пониженным pH после нанесения антиоксидантного состава, мы изучили экспрессию молекул, связанных с функционированием кожного барьера, с помощью иммунофлуоресценции. В качестве первичных антител анти-филаггрин (ab81468, Abcam plc., UK; 1: 100), антитела против инволюкрина (ab53112, Abcam; 1: 100) и против лорикрина (ab85679, Abcam; 1: 100) инкубировали в течение 24 ч при комнатной температуре. Конъюгат козьего анти-кроличьего IgG (H + L) Alexa Fluor 555 (A-21428, Thermo Fisher Scientific; 1: 500) и козий анти-кроличий IgG H&L (FITC) (ab6717, Abcam; 1: 2000) использовали в качестве вторичных. Образцы промывали трис-буферным физиологическим раствором — Твин 20 и устанавливали с помощью Vectashield, содержащего DAPI. Образцы контролировали с помощью лазерного сканирующего микроскопа и анализировали с помощью программного обеспечения LSM 5 Image Browser (Carl Zeiss AG).
Статистический анализ
Данные были проверены на статистическую значимость с использованием t-критерия, U-критерия Манна-Уитни или одностороннего дисперсионного анализа. Результаты исследования были статистически значимыми при р <0,05. Все точки данных исследования in vitro указаны как средние значения и стандартные отклонения, а статистические различия между группами определялись с использованием непарного t-критерия. Значения p <0,001 (***), <0,01 (**) и <0,05 (*) считались статистически значимыми в этом исследовании. Все статистические анализы были выполнены с использованием IBM SPSS Statistics для Windows версии 23.0
Полученные результаты
Клиническая эффективность
Средний балл по GPS составлял 3,16 ± 0,73 на исходном уровне, который снизился до 2,66 ± 0,52 на стороне, где применялись антиоксиданты, и до 3,00 ± 0,58 на стороне контроля (p <0,05).
Профиль безопасности
Через четыре недели побочных эффектов не было, и не было случаев выбывания пациентов из-за побочных эффектов. Обе стороны, обработанные антиоксидантами, и контрольная группа показали снижение индекса меланина через четыре недели (с 155,50 ± 20,53 до 150,28 ± 19,63 и с 158,44 ± 20,83 до 155,89 ± 23,04, соответственно; p> 0,05). Обе стороны показали снижение индекса эритемы через четыре недели, но не было статистически значимой разницы между сторонами (с 341,94 ± 63,10 до 332,67 ± 60,01 и с 354,00 ± 62,70 до 344,78 ± 60,21 соответственно; p> 0,05).
Анализ in vitro доставки антиоксидантного препарата с помощью лазера
Воздействие УФ-А индуцировало подавление TGF-β, COL3A1 и FGF2 в 6,25, 4,35 и 2,13 раза соответственно. После обработки FMRF TGF-β и COL3A1 были значительно усилены по сравнению с группой, получавшей только УФ-A, а уровни FGF2 были даже увеличены в 1,29 раза по сравнению с положительными контролями. Кроме того, обработка антиоксидантным препаратом привела к дальнейшему увеличению транскрипции FGF2, в 1,86 раза по сравнению с положительным контролем.
После воздействия УФ-А FMRF генерировал MTZ, денатурация коллагена достигала дермы. Эксплантированная кожа показала повышенную экспрессию COL3A1, обнаруженную с помощью окрашивания трихромом Массона, после однократной обработки FMRF импульсного типа; эта экспрессия дополнительно увеличивалась после обработки антиоксидантным составом.
Удивительно, но применение антиоксидантной композиции не повлияло на уровни экспрессии филаггрина и лорикрина на роговом слое или во всех слоях эпидермиса.
Обсуждение результатов
Мы оценили эффективность и безопасность применения антиоксидантной композиции после лечения FMRF среди пациентов с фотостарением. Клинические признаки фотоомоложения, такие как объем средней зоны лица и толщина дермы, улучшились больше на обработанной стороне, чем на необработанной стороне лица. После процедуры побочных реакций со стороны кожи у пациентов не было. Кроме того, немедленное нанесение антиоксидантного состава после лазерной обработки предотвращает простои после лечения.
Известно, что радиочастотные устройства вызывают плазменную искру при облучении кожи. В предыдущих исследованиях глубина и ширина микроканала, индуцированного фракционным CO2-лазером на модели кожи свиньи ex vivo, увеличивались с уровнем используемой энергии. Предыдущие исследования RF-лечения показали, что энергия, генерируемая каждым столбиком в MTZ, минимально распространяется на окружающие ткани, обеспечивая, таким образом, стабильность эпидермиса между каждым MTZ. Для нацеливания на фотостарение кожи требуются глубоко проникающие микроабляционные зоны в качестве канала для активной доставки молекул, чтобы вызвать достаточный клинический эффект. Лечение FMRF было предложено как эффективная альтернатива LADD абляционным фракционным лазерным системам, поскольку его можно использовать для создания микропоры с помощью своих микроигл.
Мы использовали ex vivo модель фотостарения для оценки потенциальных молекулярных и гистологических изменений после FMRF и LADD антиоксидантного состава. Как правило, неоколлагенез, индуцированный FMRF, ожидается через 1-3 месяца после однократного лечения. Тепловой ответ кожи на лечение FMRF вызывает каскад восстановления тканей, ведущий к долгосрочному ремоделированию дермы с повышенным синтезом коллагена.
В целом процедуры фотоомоложения обычно вызывают значительный дискомфорт у пациента, длительное время простоя и побочные эффекты, такие как постпроцедурная эритема и гиперпигментация. Однако было продемонстрировано, что включение местных антиоксидантов облегчает процесс восстановления тканей и минимизирует время простоя после лечения. В нашем пилотном исследовании мы продемонстрировали, что нанесение антиоксидантной композиции после лечения может повысить клиническую эффективность лечения FMRF и уменьшить покраснение после лечения. Кроме того, мы продемонстрировали, что нанесение антиоксидантной композиции с низким pH действительно нарушает барьерную функцию кожи, поскольку экспрессия филаггрина и лорикрина в роговом слое не затрагивается в модели фотоповрежденной кожи ex vivo. Более того, наши гистологические данные показывают, что сочетание лечения FMRF с LADD состава, содержащего L-аскорбиновую кислоту, витамин E и феруловую кислоту, приводит к увеличению синтеза коллагена.
Основное ограничение нашего исследования — небольшой размер выборки; поэтому надежность статистического анализа необходимо проверять в более масштабных исследованиях. Период последующего наблюдения этого исследования составил всего четыре недели; поэтому необходимы долгосрочные оценки для выяснения потенциальных эффектов лечения на неоколлагенез. В этом пилотном исследовании мы предоставили предварительные доказательства, которые согласуются с нашей гипотезой о том, что местные добавки с антиоксидантами улучшают заживление ран, обеспечивая основу для восстановления и роста коллагена. Мы полагаем, что дальнейшие исследования увеличат использование мультимодальных комбинированных процедур, используя синергетический эффект между лечением FMRF и LADD различных антиоксидантных составов, улучшая лечение кожи в целом.
В заключение мы обнаружили, что использование комбинированного антиоксидантного препарата увеличивало толщину дермы после лечения FMRF и уменьшало постпроцедурную эритему и время простоя пациента. Кроме того, мы продемонстрировали устойчивый эффект лазерной доставки антиоксидантного препарата на ремоделирование внеклеточного матрикса in vitro. Необходимы дальнейшие клинические исследования с участием большего числа пациентов и продолжительным периодом наблюдения для поддержки комбинированного использования лечения FMRF и применения антиоксидантов для обновления кожи.