Когда рана после удаления зуба закрывается, эпителий слизистой оболочки препятствует образованию новой костной ткани, вторгаясь в лунку после удаления зуба. Таким образом, высота альвеолярного гребня уменьшается, вызывая значительное угнетение слизистой оболочки альвеол. В этом исследовании мы создали модель удаления зуба и изучили влияние лазерного излучения с помощью CO2 и диода на динамику экспрессии миофибробластов через α-SMA и TGF-β1.
После удаления зубов самцов крыс Wistar в возрасте 5 недель их разделили на две группы лазерного лечения (лазерное излучение CO2 или диодного лазера было облучено в лунку после удаления зуба) и группу без лечения лазером (контрольная группа). Окружающие ткани, включая лунку для удаления зуба, были удалены через 3, 5, 7 и 21 день после удаления зуба, а экспрессия α-SMA и TGF-β1 была проверена с помощью иммуногистологических методов (по 6 животных в каждой группе и в каждый период, 72 всего животных).
α-SMA-положительные клетки и TGF-β1-положительные площади были значительно ниже в двух группах лечения лазером, чем в контрольной группе. В частности, диодная группа почти не имела TGF-β1-положительных областей на 21-й день, когда заживление после удаления зуба считалось завершенным.
Облучение ран после удаления зубов как CO2, так и диодным лазером уменьшает α-SMA-положительные клетки и TGF-β1-положительные области. Кроме того, он вызывает снижение экспрессии миофибробластов и подавляет инвазию эпителия слизистой оболочки в лунку экстракции. Таким образом, лазерное излучение может создавать пространство для образования новой кости, а также способствовать сохранению лунок.
Вступление
Удаление зуба может уменьшить высоту альвеолярного гребня. Следовательно, сохранение лунки важно для поддержания высоты альвеолярного гребня, способствуя заживлению ран после удаления зуба.
Одним из руководящих принципов лечения зубов с помощью лазера, предложенного Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) США, является коагуляция участков экстракции, в котором четко рекомендуется использовать CO2-лазер и диодный лазер в качестве устройств для этого лечения. Разница между CO2-лазером и диодным лазером обусловлен его характеристикой длины волны. CO2-лазер это длинноволновая волна, которая в основном может поглощаться мелким слоем облученной ткани. Напротив, диодный лазер имеет короткую длину волны, которая может проникать в глубокий слой. Однако эти характеристики различаются, оба обладают достаточным лечебным действием на облученные ткани. В последние годы клинические и базовые отчеты показали, что лазерное облучение после удаления зуба способствует заживлению ран. Однако сообщений о сохранении высоты альвеолярного гребня нет.
В наших предыдущих отчетах была проведена гистопатологическая проверка влияния лазерного излучения на формирование альвеолярной кости на модели удаления зуба крысы с использованием двух типов лазерных устройств, рекомендованных FDA, и сообщалось, что уровень кости лунки экстракции сохранялся.
Во время процесса заживления обычная рана после удаления зуба сопровождается инвазией эпителия слизистой оболочки, также известной как сокращение рубца. При больших травмах и заживлении хирургических ран фибробласты в грануляционной ткани обычно дифференцируются в миофибробласты с характеристиками сокращения гладких мышц за счет экспрессии TGF-β1. Очень важно, чтобы поверхность раны немедленно закрылась. Однако экспрессия миофибробластов вызывает образование рубцовой ткани и сокращение рубца на поверхности раны, что приводит к эстетическим проблемам, а также к дисфункции. Когда в удаленной ране происходит сокращение рубца, пространство для образования новой кости в выемочной лунке альвеолярной кости сокращается. Следовательно, подавление сокращения рубцов важно для сохранения лунок.
В последние годы исследования воздействия лазера на рубцовую ткань кожи показали снижение экспрессии миофибробластов и TGF-β1, уменьшение образования и сокращения рубцовой ткани и подавление избыточного производства коллагеновых волокон. Fukuoka et al. сообщили, что облучение CO2-лазером раны верхней губы не имело эстетических проблем или дисфункции. Тем не менее, очень мало сообщений о динамике слизистой оболочки полости рта после лазерного облучения для рубцевания, и нет сообщений об эпителии слизистой оболочки раны после удаления зуба.
Поэтому в этом исследовании мы создали модель удаления зуба крысы и изучили влияние излучения CO2-лазера и диодного лазера на инвазию эпителия слизистой оболочки после удаления зуба в лунку, сосредоточив внимание на маркере экспрессии миофибробластов α-SMA и динамика TGF-β1, связанная с дифференцировкой миофибробластов.
Материалы и методы
Эксперимент, в котором в качестве экспериментальных животных использовали крыс, проводился в соответствии с Руководством ARRIVE, основанным на Руководстве по проведению экспериментов на животных в стоматологическом университете Осаки (номер одобрения: 18-01008). В исследовании использовались 72 крысы-самцы линии Wistar в возрасте 5 недель (масса тела 130–150 г). Что касается среды выращивания, каждая клетка содержала по три крысы, где для бесплатного потребления были доступны твердый корм и водопроводная вода. В помещении для выращивания поддерживалась комнатная температура 24 2 C и влажность 50 5%. Цикл свет-темнота повторялся каждые 12 ч. Экспериментальная группа, получившая лазерное облучение после удаления первого моляра верхней челюсти, была разделена на две группы: диодная группа и группа СО2. Тем не менее, термин «группа лечения лазером» будет использоваться для обозначения группы диодов и группы CO2 в этом исследовании. Контрольная группа не получала лазерное облучение после удаления зуба. Крыс наблюдали через 3, 5, 7 и 21 день после удаления зуба. Проверка проводилась соответственно группами по шесть человек в каждый период.
Хирургическая процедура, лазерные устройства и соответствующие условия облучения были реализованы аналогично нашим предыдущим исследованиям. В экспериментальном методе после общей анестезии с ингаляцией изофлураном первый моляр на левой стороне верхней челюсти был удален с использованием корневого элеватора и противомоскитных щипцов для крыс. Первый моляр был выбран для экспериментов, потому что удаление могло быть выполнено полностью по сравнению со вторым моляром, что могло помочь избежать перелома зуба или разрушения альвеолярной кости в наших предварительных экспериментах. После экстракции в контрольной группе выполняли компрессионный гемостаз сухим ватным диском. Более того, в группах лечения лазером не выполнялся компрессионный гемостаз сразу после удаления; вместо этого они получили высокоинтенсивную лазерную терапию (HILT) для образования искусственных корок путем коагуляции и карбонизации поверхностного слоя крови, как только кровь достигла высоты слизистой оболочки лунки экстракции. Кроме того, струп был приварен к слизистой оболочке вокруг раны после удаления зуба, чтобы предотвратить ее падение. На следующий день после удаления зуба контрольная группа подверглась дезинфекции диамитолом. После того же процесса дезинфекции группы лечения лазером были подвергнуты фотобиомодуляционной терапии (PBMT), которая, как ожидалось, способствовала заживлению ран.
Иммуногистохимическое исследование
Моноклональное антитело против альфа-актина гладких мышц человека (α-SMA), которое является маркером экспрессии миофибробластов, и антитело трансформирующего фактора роста-β1, который участвует в дифференцировке миофибробластов и апоптозе, использовали в качестве первичных антител для иммуноокрашивания. Что касается подготовки образцов, после умерщвления крыс передозировкой анестетика в каждый день наблюдения после удаления зуба окружающие ткани, включая лунку для удаления, иссекали и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 48 часов. Размер образца был задан областью квадратной формы (10 мм с каждой стороны), которая содержит выемку для экстракции и второго моляра целиком.
Затем образцы декальцинировали 10% -ным раствором ЭДТА в течение 3 недель, обезвоживали путем погружения образцов в серию спиртовых растворов возрастающих концентраций и заливки их в парафин. Кроме того, сагиттальный непрерывный срезанный образец толщиной 4 мкм был приготовлен с использованием микротома. Нарезанные образцы депарафинизировали, гидрофилизировали и подвергали обработке активации антигена микроволновым облучением в течение 5 мин. Для подавления эндогенной пероксидазы блокирующим реагентам (DAKO Japan Inc) давали действовать в течение 5 мин. Образцы промывали дистиллированной водой и погружали в буфер трис-соляной кислоты на 5 мин. После этого образцы реагировали с первичными антителами, которые подвергались 50-кратному разведению при комнатной температуре в течение 1 часа. Образцы промывали и давали возможность взаимодействовать со стрептавидином, меченным пероксидазой, в течение 10 мин. Затем их контрастировали с помощью окрашивающего раствора гематоксилина Майера и наблюдали под оптическим микроскопом.
Измерение количества α-SMA-положительных клеток и областей экспрессии TGF-β1
Количество положительных по α-SMA клеток измеряли в области образования грануляционной ткани на поверхности лунки экстракции или собственной пластинке в ткани, взятой с того же места. Количество α-SMA-положительных клеток измеряли в пределах 150 мкм в вертикальном и горизонтальном направлениях в трех местах с четким окрашиванием. Сначала рассчитывали соотношение TGF-β1-положительных площадей на единицу площади, а затем соответственно рассчитывали среднее значение для каждой группы. Для измерения использовался цифровой микроскоп. После сканирования изображения было выполнено измерение с использованием Scion-image. Оценка проводилась одним соавтором в слепом тесте. Измеренные значения были показаны как среднее ± стандартное отклонение, а статистически значимая разница была определена с помощью точного критерия Фишера с уровнем значимости менее 5% (p <0,05).
Полученные результаты
Иммуногистологический анализ и результаты измерения антител против αSMA
Иммуногистологические окрашенные изображения антител против α-SMA показаны на фиг. 2A – L, а результаты измерения количества положительных клеток показаны на фиг. 2M. Экспрессия α-SMA-положительных клеток регистрировалась на протяжении всего периода наблюдения в контрольной группе. Пик числа положительных клеток приходился на 5 день, а затем он демонстрировал тенденцию к снижению на 7 и 21 день. Число положительных клеток на 21 день было почти таким же, как и на 3 день. Точно так же количество положительных ячеек как в группе CO2, так и в группе диодов достигло пика на 5-й день и после этого показало тенденцию к снижению. На ранней стадии заживления на 3-й день количество α-SMA-положительных клеток было значительно ниже в группах лечения лазером (группа CO2: 16,65 ± 8,79; группа диодов: 3,36 ± 1,56), чем в контрольной группе (38,28 ± 10,51). В частности, в группе диодов было лишь небольшое количество положительных ячеек на α-SMA. На 5-й и 7-й дни количество α-SMA-положительных клеток в каждой группе увеличивалось по крайней мере в 2–3 раза по сравнению с 3-м днем; однако, в отличие от контрольной группы, количество положительных клеток в группе, получавшей лечение лазером, было меньше. Число положительных клеток было значительно ниже в группе диодов на 5-й день и в группах лазерной обработки на 7-й день. На 21-й день не было значимой разницы между контрольной группой (41,28 ± 8,28) и группой CO2 (35,35 ± 4.19); однако в группе диодов (24,67 ± 8,25) это число было значительно меньше.
Иммуногистологический анализ и результаты измерения анти-TGF-β1-антител
В контрольной группе на протяжении всего периода наблюдения наблюдалась TGF-β1-положительная область. Положительные области достигли максимума на 7-й день и уменьшились на 21-й день. Группа CO2 показала тенденцию к увеличению к 21 дню. В группе диодов на 5 и 7 дни наблюдалась тенденция к увеличению; однако на 21 день почти не было отмечено положительных участков. На 3-й день положительные области имели тенденцию быть меньше в группе CO2 (6,81 ± 2,36%), и они были значительно меньше в группе диодов (3,08 ± 1,13%), чем в контрольной группе (9,11 ± 3,30). На 5-й день группа CO2 составила 13,39 ± 5,34%, группа диодов — 6,43 ± 2,50%, а контрольная группа — 25,84 ± 9,45%. По сравнению с контрольной группой, положительные области были примерно на 50% меньше в группе CO2 и примерно на 75% меньше в группе диодов. Результаты на 7-й день были почти такими же, как на 5-й день. На 21-й день положительные области контрольной группы (19,22 ± 6,53%) и группы CO2 (15,81 ± 3,35%) были аналогичными, в то время как экспрессия в группе диодов (0,58 ± 0,42%) практически исчезли, показав значительную разницу.
Обсуждение результатов
Основываясь на предыдущих отчетах о том, что облучение CO2-лазером или диодным лазером подавляет образование рубцовой ткани, в этом исследовании изучалась динамика миофибробластов через α-SMA-положительные клетки, а также TGF-β1-положительные области, участвующие в дифференцировке миофибробластов. В результате количество α-SMA-положительных клеток и TGF-β1-положительных областей имело тенденцию к значительному снижению в группах лечения лазером по сравнению с контрольной группой во все периоды после удаления зуба/
В клинической практике Tawfic и Makboul оценили рубцовую ткань после лазерного облучения фракционным CO2-лазером и сообщили, что улучшение рубца было вызвано уменьшением количества миофибробластов со значительным снижением экспрессии TGF-β1. Сообщалось, что диодный лазер продемонстрировал те же эффекты. Фундаментальные исследования показали, что только небольшое количество миофибробластов появляется при использовании CO2-лазера или диодного лазера после создания раневой поверхности с помощью скальпеля на задней части языка и на коже в спина крыс. Хотя ожидается, что лазерное облучение станет лечением первой линии для уменьшения образования рубцовой ткани, необходимы дальнейшие разъяснения для создания доказательной медицины.
На основе этого исследования и наших предыдущих отчетов мы предложили модель сохранения лунок после удаления зуба в каждом лазерном устройстве. Наши предыдущие отчеты показали, что активное ремоделирование кости в мелком слое удаления лунка возникает рано после облучения CO2-лазером, что может предотвратить инвазию эпителия слизистой оболочки. Более того, результаты этого исследования показали меньшее количество α-SMA-положительных клеток и TGF-β1-положительных областей в группе СО2, чем в контрольной группе. Соответственно, можно сделать вывод, что снижение экспрессии миофибробластов облучением CO2-лазером снижает инвазию слизистой оболочки в лунку экстракции.
В группе диодов α-SMA-положительные клетки и TGF-β1-положительные области были значительно ниже, чем в группе CO2. В наших предыдущих отчетах после облучения диодным лазером уровень кости в лунке экстракции поддерживался даже без мостикового остеогенеза, что также было обнаружено в α-SMA-положительных клетках во время процесса заживления ран в этом исследовании. Мы полагаем, что это связано с тем, что уменьшение инвазии слизистой оболочки в лунку экстракции, что связано с недостаточным количеством α-SMA-положительных клеток и TGF-β1-положительных областей в процессе заживления, способствовало созданию пространства для кости. Кроме того, при двух типах лазерного облучения коагуляция и карбонизация крови, которая заполнила лунку экстракции через HILT с образованием искусственной корки, предотвратила вторжение в эпителий слизистой оболочки. Этот вывод согласуется с отчетом Хюбша, в котором говорится, что расположение тромба внутри лунки экстракции влияет на высоту будущего образования новой кости.
Однако остается осторожный момент для работы с лазером. Нам нужно вставить наконечник лазера в гнездо для извлечения для облучения диодным лазером. При небрежном контакте с наконечником лазера альвеолярная кость может быть поражена чрезмерным нагревом при неправильной процедуре. С этой точки зрения CO2-лазер является более безопасным устройством, поскольку не требует вставки наконечника лазера в гнездо для извлечения. С другой стороны, длина волны диодного лазера короче, чем длина волны CO2-лазера, который может достигать более глубоких и широких участков облучаемой ткани. Это было бы полезно в некоторых клинических случаях. Тем не менее, оба лазерных устройства, использованные в этом исследовании, рекомендованы FDA и определены как безопасные, не требующие каких-либо сложных навыков для работы.
Таким образом, было высказано предположение, что подавление рубцового сокращения эпителия слизистой оболочки после удаления зуба с помощью излучения лазера CO2 или диодного лазера способствует образованию пространства для образования новой кости в лунке после удаления, что приводит к последующему сохранению лунки.