Цель: Изучить взаимосвязь между химическим составом, результатами биопсии и клиническим исходом татуировок, обработанных лазером.
Дизайн: Наблюдательное неслепое ретроспективное исследование.
Участники: Двадцать пациентов, которым была сделана биопсия татуировок, обработанных лазером.
Основные критерии оценки: Образцы биопсии анализировали после лазерной обработки и регистрировали глубину измененных частиц. Ультраструктуру измененных частиц исследовали с помощью электронной микроскопии. Наличие неорганических химикатов определяли методом дифракции рентгеновских лучей. Была предпринята попытка корреляции между дифракцией рентгеновских лучей, микроскопией и клиническим ответом.
Результаты: Из 20 татуировок 7 посветлели, 9 не изменились и 4 после лазерной обработки потемнели. Существовала значительная связь между присутствием диоксида титана и плохим ответом на лазерную терапию. Микроскопические исследования показали переменные изменения в частицах чернил, но наблюдалась тенденция к остаточному темно-зеленому пигменту в стойких татуировках. Также на затемненных образцах поверхностно наблюдалась круглая темная пунктирная линия.
Выводы: Титан слишком часто встречается в татуировках, плохо поддающихся лазерной обработке. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы показать, является ли этот металл основной причиной плохой реакции.
Многие татуировки устойчивы к лазерному лечению, особенно те, которые содержат синий, пурпурный, желтый, зеленый и телесные красители. Например, в то время как некоторые зеленые татуировки полностью исчезают всего после 2-3 сеансов лечения, другие не становятся светлее или даже могут стать темнее.
Механизм потемнения татуировок после лазерной обработки до конца не изучен. Одним из факторов может быть вызванное лазером восстановление металлических соединений, используемых в некоторых красителях. Потенциальным преступником является диоксид титана (TiO2), который становится все более популярным белыми чернилами, используемыми для усиления блеска татуировок. Титан чаще всего встречается в зеленых, белых и телесных татуировках; тем не менее, он был обнаружен в татуировках практически любого цвета. Чтобы изучить возможную связь между TiO2 и реакцией татуировки на лазерную обработку, мы исследовали металлический состав серии обработанных татуировок в этом пилотном исследовании.
Предметы и методы
Образцы биопсии были получены в этом ретроспективном анализе от согласившихся пациентов, участвующих в протоколах лечения татуировок, с использованием рубинового лазера с переключением добротности или Nd: YAG-лазера. Каждый пациент лечился у опытного дерматолога по протоколу, который, как ожидалось, обеспечил адекватный клинический ответ. Зеленые татуировки обрабатывали рубиновым лазером с плотностью потока энергии от 4 до 7 Дж / см2 и размером пятна от 5 до 6 мм. Красные татуировки обрабатывали лазером Nd: YAG с удвоенной частотой с плотностью энергии от 2 до 4 Дж / см2 и размером пятна от 2 до 3 мм. Черные татуировки обрабатывали лазером Nd: YAG на длине волны 1064 нм с плотностью потока энергии от 4 до 8 Дж / см2 и размером пятна от 2 до 3 мм. Перед биопсией пациенты прошли не менее 6 процедур с использованием одного или нескольких лазеров. Всего в исследование было включено 20 пациентов.
Для большинства татуировок были доступны только образцы биопсии после обработки. Образцы биопсии обрабатывались одним из двух способов. Некоторая ткань была обработана для заливки парафином и окрашена гематоксилин-эозином. Репрезентативные срезы оставляли неокрашенными и использовали для оценки плотности частиц чернил и глубины микроскопического осветления, индуцированного лазером. Остальную ткань обработали для электронной микроскопии. Образцы фиксировали в 4% глютаральдегидеин 0, 1 моль / л какодилатном буфере, обезвоживали и заливали эпоксидной смолой. Постфиксатионин тетроксид осмия был исключен для улучшения рентгеноструктурного анализа. Срезы толщиной 1 мкм исследовали либо неокрашенными, либо окрашивали толуидиновым синим O. Тонкие срезы окрашивали насыщенным уранилацетатом и свинцовым пятном Сато или оставляли неокрашенными и исследовали в электронном микроскопе (CM10; Phillips, Hillsboro, Ore).
Все образцы прошли рентгеноструктурные исследования на предмет обнаружения металлических элементов. Залитые в парафин образцы вырезали до 10 мкм и устанавливали непосредственно на алюминиевый стержень для использования в сканирующей электронной микроскопии. Парафин удаляли с образца ксилолом, а на поверхность шлифа наносили слой углерода. Эти образцы подвергали рентгеновскому микроанализу на сканирующем электронном микроскопе с детектором рентгеновского излучения. Образцы, обработанные эпоксидной смолой, вырезали при длине волны 90 нм и помещали на сетку, покрытую углеродом и поливинилформом, для исследования с помощью просвечивающего электронного микроскопа, оборудованного детектором рентгеновских лучей. Оба метода производили спектральные сигнатуры для элементов, присутствующих в ткани.
Для определения наличия значительной корреляции между присутствием титана и сопротивлением татуировке и / или потемнением использовался тест Фишера. Мы исключили татуировки, содержащие оксиды железа, из анализа данных, поскольку известно, что они темнеют при обработке.
Чтобы наблюдать прямые эффекты лазерного облучения на титан, крем с 5% TiO2 облучали Nd: YAG-лазером с модуляцией добротности с флюенсом. 7 Дж / см2.
Полученные результаты
Из 20 исследованных татуировок 7 значительно светились по всей татуировке, 9 были, по крайней мере, частично устойчивыми, а 4 стали темнее. Из 13 татуировок, которые не помогли, все, за исключением 2, содержали титан, тогда как из 7 татуировок, которые значительно посветлели после лазерной обработки, только 2 содержали титан. При использовании точного теста Фишера была выявлена значительная связь между присутствием титана и плохим ответом на лазерную терапию (P = 0, 02).
В целом татуировки, которые не смогли осветлить, показали более высокую плотность чернил, чем те, которые дали положительный результат. Все образцы цветного (не черного) пигмента оказались неоднородными при световой микроскопии, показывая смеси окрашенных и неопределенных коричнево-черных гранул. В группе устойчивых зеленых татуировок были замечены 2 типа пигментных гранул: (1) большая округлая глобулярная гранула (диаметр 2-5 мкм;), которая при обработке имела тенденцию распадаться на более мелкие круглые частицы различного размера и (2) кристаллические гранулы (5-10 мкм в диаметре;), которые показали тенденцию к «расколу» при терапии. Изменения формы гранул были менее заметными при увеличении глубины образцов. В обоих типах образцов после обработки наблюдался переход от полупрозрачных коричневатых гранул (0, 5-1 мкм) с небольшими черными включениями (типа точечной), расположенных поверхностно, к появлению более крупных, более непрозрачных гранул ярко-зеленого цвета (1-3 мкм), начиная с глубины около 500 мкм в дерме. Среди более глубоких гранул были разбросаны точечные агрегаты более мелких гранул размером 1 мкм, подобные тем, которые наблюдаются в поверхностных областях биопсии. Количество этих более мелких темных точек оставалось постоянным на глубине от 500 до 1500 мкм в коже. Однако, если говорить более поверхностно, их количество постепенно уменьшалось, так что они редко наблюдались в самых верхних срезах образца (глубина 200 мкм).
С помощью просвечивающей электронной микроскопии устойчивые зеленые татуировки показывают некоторые клетки с лизосомами, содержащими бледный материал с несколькими темными частицами на обработанных участках. (Примечание: в этом исследовании мы определили частицу как небольшую структуру, которую можно идентифицировать с помощью электронной микроскопии. Она отличается от гранулы, которую мы определили как самую маленькую структуру, наблюдаемую при обычной световой микроскопии, обычно диаметром от 0, 5 до 10 мкм, то есть лизосома, содержащая частицы). Другие образцы показали более кристаллические частицы, равномерно распределенные в цитоплазме. В обоих случаях (глобулярный и кристаллический) в областях из более глубоких слоев кожи, предполагаемых необработанных областях, были обнаружены более крупные и однородные частицы.
На 4 татуировках, которые подверглись потемнению, световая микроскопия показала большие гранулы (1-3 мкм) глубже в дерме, которые выглядели неизмененными после лазерной обработки. Исключительно в виде тонкой полосы (толщиной около 100 мкм;) на поверхностных частях образцов (глубиной около 200-300 мкм), меньшие (1 мкм), темные округлые тела выглядели как пунктирные внутри этих гранул. В более поверхностных («обработанных») областях образцов эти маленькие тела были распределены более рыхло, по сравнению с более агрегированным, более плотным, комкованным распределением в необработанных более глубоких областях срезов. По данным просвечивающей электронной микроскопии, внешний вид был аналогичным, с большей неоднородностью, видимой на поверхности, где образцы показали смесь очевидно неизмененных частиц (приблизительно 500 нм в диаметре на электронной микроскопии) и более мелких (50-100 нм) и «измененных» затемненных частиц.
Ртуть была обнаружена в одном затемненном красном образце. Гистологические данные были аналогичны результатам трех других затемненных татуировок, за исключением того, что в поверхностной (то есть обработанной) дерме были как более крупные красноватые гранулы, так и более мелкие, предположительно измененные, гранулы.
Микроскопически, на обработанных татуировках, которые значительно осветлялись (большинство из которых были черными), были пятна и светло-коричневый цвет на поверхности, с незначительным перцем или без перца. Глубже в дерме отмечались однородные черные гранулы. С помощью просвечивающей электронной микроскопии обработанные части образцов показали смесь электронно-плотных и электронно-световых частиц, причем многие из электронно-световых (измененных) частиц имели немного увеличенный размер (60-100 против 40 нм) по сравнению с их неизмененными электронно-светящимися частицами.
Лазерное облучение крема с 5% TiO2 привело к резкому немедленному изменению цвета от ярко-белого до голубовато-черного.
Обсуждение результатов
Механизмы удаления татуировок после облучения лазером с модуляцией добротности до конца не изучены. Предполагается, что поглощение энергии коротких импульсов вызывает высокие температуры в частицах чернил, что приводит к гибели фагоцитарных клеток, содержащих чернила. Очистка татуировок может происходить за счет фрагментации частиц, гибели фагоцитарных клеток и последующего перехода через лимфатические сосуды, трансэпидермальную элиминацию или внутренние изменения оптических свойств в гранулах пигмента. Устойчивость к лазерной обработке может быть связана с ранним репагоцитозом частиц фибробластами, чрезмерным количеством чернил, глубиной частиц, неспособностью изменять частицы под действием температуры и давления и электрохимическими изменениями валентного состояния неорганических красителей, подверженных воздействию облучение мощным лазером, как описано ниже.
Сообщалось, что татуировки, содержащие оксид железа, коричнево-красный ингредиент, широко используемый в красных, розовых и телесных татуировках, приводят к обесцвечиванию черного цвета при обработке рубиновым лазером с модуляцией добротности. Считается, что этот механизм включает восстановление оксида железа, окрашенного в цвет ржавчины, до оксида железа, который имеет черный как уголь. Аналогичное явление может быть связано с белыми и другими не содержащими железа чернилами, содержащими титан. В необработанной татуировке титан находится в ярко-белой форме TiO2. Было показано, что высокоинтенсивное лазерное облучение приводит к восстановлению Ti4 + до Ti3 +, который отвечает за синий цвет. Мы продемонстрировали это изменение цвета, облучив обогащенный титаном солнцезащитный крем.
Топе и др. изучили гели для татуировок, содержащие TiO2 и оксид железа, и обнаружили, что изменения зависят как от длины волны, так и от длительности импульса. Наиболее важно то, что они не смогли вызвать потемнение татуировки в татуировках с длительностью импульса более 1 миллисекунды, что позволяет предположить, что для потемнения татуировочных чернил требуется пороговая плотность мощности.
Интересно, что есть доказательства, подтверждающие спонтанное обесцвечивание чернил на татуировках, содержащих титан. Это наблюдение подтверждается in vitro, когда на воздухе наблюдается «обесцвечивание» синего обесцвечивания через 3–4 месяца.
Белые чернила, на 95% состоящие из TiO2, обычно используются для осветления зеленых, синих, желтых и пурпурных татуировок. Полученные смеси изготавливаются таким образом, что зеленые чернила, например, обычно состоят из примерно 30-40% TiO2. (Эти данные были получены в ходе недавно завершенного экспериментального исследования с использованием нового прибора для энергодисперсионного рентгеновского микроанализа). Следовательно, возможно, что татуировки с большой долей титана станут глубоко черными при обработке лазером с модуляцией добротности, в то время как другие татуировки с меньшей титановой «нагрузкой» темнеют при лазерном облучении так мало, что они выглядят не слишком светлыми. При повторной обработке зеленых татуировок один из возможных сценариев состоит в том, что зеленая «органическая» часть, по крайней мере, поверхностно, удаляется, тогда как титановая часть темнеет.
Одной из трудностей в этом исследовании является сопоставление результатов электронной микроскопии и световой микроскопии с клиническими данными. Например, мы отметили, что в устойчивых зеленых биоптатах имеется значительное количество оставшихся зеленых чернил у основания макроскопического образца с менее выраженным зеленым цветом на поверхности. Это было подтверждено гистологически, поскольку мы видели более крупные зеленые гранулы глубже в обработанных образцах. Это наблюдение предполагает, что простое применение большей поверхностной плотности энергии удалит оставшийся темно-зеленый пигмент. По-видимому, более высокие влияния позволят преодолеть зависящее от глубины ослабление лазерного луча, а также любую конкуренцию за поглощение света TiO2, смешанным с более глубоким оставшимся зеленым пигментом. Соответственно, более темно-зеленый пигмент будет удален, в то время как любое легкое потемнение (поседение) чернил должно быть практически незаметным.
Предположительно, все, что отвечает за потемнение чернил, будет иметь тенденцию происходить выше в образце, где подповерхностная плотность потока энергии наибольшая. На потемневшей рыжевато-коричневой татуировке мы заметили усиление штрихов при световой микроскопии, что могло бы объяснить сильное потемнение; возможно, это был измененный TiO2, поскольку мы не обнаружили более глубоких пятен в образце. С другой стороны, нам не удалось определить надежный гистологический коррелят сопротивления в зеленых татуировках, поскольку пунктирность была отмечена как на поверхностных, так и на глубоких участках образца и более распространена глубже в образце. Можно только строить догадки относительно реальных физических изменений, происходящих в образце во время лазерного облучения.
У исследования несколько ограничений. Во-первых, татуировки не все подвергались одинаковому протоколу обработки; однако каждая татуировка обрабатывалась опытным дерматологом по протоколу, который, как ожидается, приведет к неоптимальному очищению. Во-вторых, татуировки не соответствовали анатомическому месту или возрасту пациента, типу кожи, возрасту татуировки, глубине пигмента, плотности пигмента или цвету чернил. В-третьих, хотя наш анализ обнаружил присутствие всех составляющих металлов в каждой татуировке, он не был предназначен для определения относительного количества металла, присутствующего в каждом образце. Оптимально искать совпадающие элементы управления между 3 группами (стойкость, затемнение и осветление) с учетом местоположения, возраста и, что наиболее важно, цвета чернил. В этом ретроспективном исследовании мы первоначально ограничили набор татуировок, которые были устойчивыми или потемнели в результате лечения. Впоследствии мы добавили «группу хороших респондентов» в качестве контроля. К сожалению, группа хорошо ответивших не могла быть сопоставлена по цвету, поскольку мы заметили, что непропорционально большое количество зеленых татуировок реагировало плохо, а черные татуировки обычно реагировали хорошо. Таким образом, цвет — это смешивающая переменная; К сожалению, большинство зеленых чернил для татуировок содержат TiO2. Интересно, что врачи обычно отмечают, что зеленые татуировки лечить сложнее всего. Часто зеленая татуировка светлеет примерно на 50% после 2-4 процедур, но не может значительно осветлить даже после 20 дополнительных процедур. Отсутствие реакции на зеленые татуировки интересно, поскольку есть свидетельства того, что красный свет (александритовый лазер или рубиновый) хорошо впитывается зелеными чернилами. Однако неизвестно, играет ли TiO2 роль в сопротивлении или, наоборот, существует ли просто более высокий порог повреждения для органических азокрасителей, обычно используемых в качестве зеленых чернил для татуировок.
Зеленые татуировки не особо устойчивы к лечению; чернила других цветов также отличаются стойкостью. Например, мы обнаружили, что пурпурные и желтые чернила трудно обрабатывать, даже если они тоже демонстрируют, по крайней мере, хорошее поглощение того или иного широко используемого лазера с модуляцией добротности; эти краски также обычно содержат TiO2. Вероятно, зеленый цвет стал таким неприятным во многом из-за его преобладания. По нашему опыту, 3 наиболее распространенных цвета татуировок — это черный, зеленый и красный. Из них красный и черный хорошо реагируют в большинстве случаев, и эти чернила обычно содержат нотитан.
Окончательным испытанием TiO2 как независимого фактора риска устойчивости будет сравнение зеленых чернил с TiO2 и без него. Однако, хотя наше исследование включало 6 цветов, мы считаем, что чрезмерная представленность TiO2 у плохо ответивших и потемнение татуировок, по крайней мере, частично связано с элементным составом, а не только с татуировкой. Более того, по крайней мере для темнеющих татуировок, микроскопическая корреляция (повышенная пунктирность и неоднородность гранул после обработки) и присутствие TiO2 являются убедительным аргументом в пользу роли титана в общих наблюдениях. Результаты этого исследования должны способствовать другим исследованиям состава чернил для тату и его связи с успехом лазерного лечения. Для индивидуальной оценки роли титана, плотности чернил, глубины чернил и цвета чернил необходимо более масштабное и систематическое исследование. Неоценимы были бы эксперименты на животных моделях с нанесением контролируемых татуировок с известной концентрацией чернил и металлических компонентов. Если обнаруживаются дополнительные соединения, которые темнеют при лазерном облучении, производителям может быть целесообразно поискать альтернативные красители, чтобы в будущем могли появиться «постоянные», но «дружественные к лазеру» татуировки.