Влияние шлифовки СО2 лазером на иммуноокрашивание эпидермального р53 в фотоповрежденной коже

Цель: количественно изучить изменения в иммуноокрашивании гена-супрессора опухоли p53 после шлифовки фотоповрежденной кожи лазером на диоксиде углерода (СО2), чтобы оценить потенциальную ценность этого лечения в снижении риска прогрессирования кожной карциномы.

Дизайн: Последовательные иммуногистохимические анализы in vivo после лазерной терапии.

Другие участники: Выборка добровольцев из 11 взрослых в возрасте от 51 до 76 лет с клинически очевидными фотоповреждениями предплечий.

Вмешательство: Фокусная шлифовка CO2-лазером фотоповрежденных предплечий и серийные биопсии на исходном уровне, через 3 недели и 6 месяцев после лечения.

Основные показатели результатов: Поскольку кератиноциты с мутациями в р53 или измененная экспрессия р53 окрашивались с помощью иммуногистохимических методов, для количественной оценки экспрессии р53 использовался анализ изображений иммуногистохимически окрашенных срезов.

Результаты. Положительное иммуноокрашивание на р53 в межфолликулярном эпидермисе было отмечено у 8 из 11 субъектов на исходном уровне со средней плотностью окрашивания 250 клеток / мм2. Среднее окрашивание снизилось до 3 клеток / мм2 через 3 недели после обработки. Это снижение сохранялось на уровне 5 клеток / мм2 через 6 месяцев после шлифовки.

Важно отметить, что потенциальная профилактическая польза абляционной лазерной терапии не означает, что обработанные участки свободны от риска развития рака кожи. Предраковые и / или злокачественные фолликулярные эпителиальные клетки или интерфолликулярные эпидермальные клетки, первоначально обнаруженные латеральнее обработанной кожи, могут по-прежнему мигрировать в обработанную лазером область, обеспечивая основу для развития актинического кератоза, плоскоклеточного рака или базальноклеточного рака. Кроме того, клинически необнаруживаемые, но уже существующие раковые образования кожи, расположенные глубоко в области, обработанной лазером, могут в конечном итоге стать очевидными. Кроме того, непреднамеренная неполная шлифовка может также позволить небольшому количеству остаточных мутантных клеток пролиферировать. Однако, поскольку «риск» по определению является вопросом чисел, можно ожидать, что лечение будет иметь профилактическое значение, просто снизив вероятность того, что мутантная клетка p53 завершит трансформацию в злокачественную клетку из-за уменьшенного количества таких клеток, оставшихся после шлифовки кожи. Таким образом, развитие актинических кератозов или клинически значимых кожных карцином после шлифовки с помощью CO2-лазера может не указывать на полный отказ от профилактической эффективности процедуры, а скорее может быть вопросом того, что некоторые пациенты проигрывают «игру с числами», как мы могли ожидать. Например, хотя несколько обескураживает тот факт, что у 5 из 35 пациентов в серии, описанной Фултоном и соавторами, в течение 12 месяцев после лазерной шлифовки развились актинические кератозы или базальноклеточные карциномы, учитывая, что эти пациенты были описаны как имеющие «сильное» солнечное повреждение, это может случиться так, что у большего числа субъектов были бы подобные поражения или что 5 «неудач» привели бы к большему количеству поражений без лечения. Для изучения этих возможностей необходимы дополнительные контролируемые клинические исследования.

Несмотря на клинически очевидные фотоповреждения у всех наших испытуемых, только 8 из 11 имели значимое p53-положительное окрашивание до шлифовки. В той степени, в которой мы оценили потенциальную профилактическую пользу абляционной лазерной шлифовки в отношении иммуноокрашивания p53, мы не можем прокомментировать ценность лечения, если таковое имеется, для субъектов, у которых на исходном уровне не было p53-положительных кератиноцитов. Возможно, лечение устранит любое количество других значительных эпидермальных генетических мутаций, но это чисто предположение.

В этом исследовании в качестве места лечения использовались предплечья из-за практических ограничений на количество образцов кожи, которые можно было получить с лица. Хотя могут быть незначительные различия в реакции фотоповрежденной кожи предплечья и лица на лазерную шлифовку, нет оснований полагать, что фундаментальные механизмы заживления ран на этих участках различаются. Однако мы не можем исключить возможность того, что иммуноокрашивание p53 может быть изменено абляционной лазерной шлифовкой кожи лица другим способом, чем это было продемонстрировано в этом исследовании с использованием кожи предплечья.

Наконец, необходимо отметить, что это предварительное исследование, основанное на довольно небольшом количестве предметов. Если изменения в иммуноокрашивании p53 в конечном итоге будут использованы для оценки полезности шлифовки с помощью CO2-лазера в качестве профилактической процедуры с точки зрения развития кожных злокачественных новообразований, потребуется большее количество пациентов, обследованных в течение еще более длительных периодов после лечения. Также будут необходимы дополнительные исследования, оценивающие корреляцию между иммунореактивностью р53 и мутациями. Кроме того, оценка вариаций параметров лечения на основе характеристик пациента (например, наличия гипертрофических актинических кератозов) также может иметь значение. Результаты настоящего исследования позволяют предположить, что в этой области необходимы дополнительные работы.

Выводы. После лазерной шлифовки фотоповрежденной кожи CO2-лазером в межфолликулярном эпидермисе наблюдалось стойкое снижение иммуноокрашивания p53, которое длилось не менее 6 месяцев. Поскольку мутация или сверхэкспрессия р53 наблюдается в большинстве случаев карциномы кожи, репопуляция эпидермиса р53-отрицательными кератиноцитами после лечения теоретически должна снизить риск злокачественного прогрессирования. Представляется целесообразным дальнейшее изучение лазерной шлифовки как профилактической процедуры у пациентов с высоким риском развития рака кожи.

Лазерная шлифовка на углекислом газе (CO2) является часто используемым терапевтическим методом для улучшения внешнего вида фотоповрежденной кожи, и, как сообщается, она также успешно применяется при лечении ряда доброкачественных кожных поражений и профилактики предзлокачественных новообразований и поверхностных карцином кожи остается более спорной. В целом мало литературы, в которой оценивается эффективность шлифовки с помощью CO2-лазера при лечении актинического кератоза или других признаков предраковых заболеваний, и большинство исследований по этой теме посвящены в основном клиническим результатам. Поэтому мы стремились оценить влияние терапии CO2-лазером на фотоповрежденную кожу с количественной иммуногистохимической точки зрения.

Мутации в гене-супрессоре опухоли, p53, в высокой степени связаны с кожным плоскоклеточным раком и актиническими кератозами. (Нам известны недавние разногласия в литературе относительно того, следует ли относить актинические кератозы к подтипу плоскоклеточного рака или просто является предшественником поражения, но следующий анализ влияния лазерной шлифовки на окрашивание p53 будет проводиться независимо от этой классификации.) Кроме того, Jonason et al сообщили о частом существовании клональных популяций кератиноцитов с мутацией p53 в доброкачественной коже, которые чаще встречаются в местах, подверженных воздействию солнца. Учитывая теорию канцерогенеза «множественных ударов», незлокачественные кератиноциты с мутациями р53, вероятно, имеют более высокий риск неопластического прогрессирования и, в конечном итоге, трансформации в инвазивный рак кожи. Таким образом, наличие мутаций p53 может служить маркером как фотоповреждения, так и повышенного риска развития кожной карциномы.

Кроме того, недавняя работа El-Domyati et al продемонстрировала повышенную экспрессию р53 дикого типа в коже, подвергнутой воздействию солнца, которая была более выражена у пожилых людей. Это было связано с уменьшением количества апоптотических клеток в коже, исследованной с помощью биопсии, с возрастом на участках, подверженных воздействию солнца. Считалось, что уменьшение количества апоптотических клеток потенциально влияет на баланс пролиферации-апоптоза в пораженной коже, и, таким образом, было постулировано, что оно потенциально играет роль в онкогенезе. Следовательно, даже наличие повышенной экспрессии р53 дикого типа в фотоповрежденной коже может указывать на предраковое состояние или, по крайней мере, повышенный риск образования рака кожи.

Как мутации в гене p53, так и повышенная экспрессия белка p53 дикого типа, обнаруженная в фотоповрежденной коже человека, можно обнаружить с помощью иммуногистохимических методов. Мы пришли к выводу, что количество p53-положительных кератиноцитов может служить индикатором степени предракового состояния в ткани, исследованной с помощью биопсии. В этом исследовании мы изучили изменения в иммуноокрашивании p53 после шлифовки с помощью CO2-лазера клинически фотоповрежденной кожи, чтобы оценить потенциальную ценность этого лечения в минимизации риска прогрессирования кожной карциномы.

Методы и материалы

Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом Медицинской школы Мичиганского университета, Анн-Арбор, и информированное согласие было получено от всех участников исследования. Ткань была получена от субъектов, участвовавших в клинических испытаниях, изучающих влияние предварительной обработки третиноином на заживление ран после шлифовки с помощью CO2-лазера (неопубликованные данные авторов, 2004 г.). В исследование были включены пациенты в возрасте от 51 до 76 лет с клинически очевидным фотоповреждением предплечий. Это было проспективное, рандомизированное, слепое клиническое испытание, в ходе которого предплечья субъектов были локально обработаны CO2-лазером после 3-недельного периода серийных применений третиноина на одном предплечье и плацебо (идентичный крем транспортного средства без ретиноида) на другое предплечье. В эту статью включены только данные, полученные из биоптатов предплечий, обработанных плацебо. Используемые настройки CO2-лазера включают 300 мДж и 60 Вт с настройками компьютерного генератора шаблонов 3/5/6 и / или 3/5/9. Следует отметить, что испытуемых специально проинструктировали избегать пребывания на солнце как перед процедурой, так и в период реэпителизации ран. Образцы пункционной биопсии (3 мм) были получены на исходном уровне и на 21 день после лазерной шлифовки (после того, как произошла реэпителизация) у всех субъектов и через 6 месяцев после лечения у 6 пациентов. Было выполнено иммуногистохимическое окрашивание на р53, и анализ изображений был использован для количественного определения количества положительно окрашенных клеток. В этих исследованиях использовалось моноклональное антитело к p53 DO-7. Окрашивание проводили, как описано ранее.

Изменения в иммуноокрашивании p53, измеренные по количеству положительных клеток на квадратный миллиметр, оценивали через 3 недели и 6 месяцев после обработки CO2-лазером относительно уровней до лечения с помощью дисперсионного анализа с повторными измерениями. Средние уровни в каждой из 2 временных точек после обработки сравнивали с уровнями до обработки с помощью теста Даннета. Частота ошибок типа I была установлена ​​на уровне 0, 05. Сводная статистика включает минимальные и максимальные значения, средние и стандартные ошибки. Данные были проанализированы с помощью статистического программного обеспечения SAS.

Полученные результаты

До лечения положительное иммуноокрашивание на р53 было отмечено у 8 из 11 испытуемых. Р53-положительные клетки наблюдались в базальных и супрабазальных кератиноцитах, в кластерах и по всему межфолликулярному эпидермису. Среди субъектов с положительным окрашиванием анализ изображений показал среднюю плотность окрашивания 250 окрашенных клеток на квадратный миллиметр. Плотность окрашивания снизилась в среднем до 3 клеток / мм2 после реэпителизации ран, вызванных CO2-лазером, на 21 день после лазерной шлифовки. Таким образом, плотность p53-положительных клеток снизилась примерно до 1% от уровня до обработки. Среди 6 субъектов, которые согласились предоставить дополнительные образцы тканей через 6 месяцев после лечения, средняя плотность окрашивания оставалась сниженной в среднем на 5 клеток / мм2, или 2% от уровня до лечения. Отмеченные изменения были статистически значимыми.

Обсуждение исследования

Считается, что рак развивается в результате серии генетических «ударов» по ​​ранее нормальной ткани, которая прогрессирует от предракового состояния до инвазивного злокачественного новообразования. Одним из таких генетических ударов является мутация гена-супрессора опухоли p53, часто встречающаяся при карциномах кожи, которая способствует накоплению последующих мутаций. Терапевтический метод, снижающий количество кератиноцитов, содержащих мутации p53, должен снизить риск злокачественных новообразований, прогрессирующих до инвазивного рака кожи.

Из-за хорошо известной способности шлифовки с помощью CO2-лазера воспроизводимо удалять весь межфолликулярный эпидермис, эта процедура должна устранить большой процент р53-мутантных кератиноцитов в обработанной коже. Если репопулирующие кератиноциты не содержат мутаций p53, следует снизить риск развития рака кожи. Фактически, предыдущее исследование предполагает, что регенерированный эпидермис, наблюдаемый после заживления вызванных лазером CO2 ран на фотоповрежденной коже, не имеет значительной гистологически выявляемой атипии, и предыдущие клинические исследования сообщили об успешном устранении актинического кератоза и поверхностного рака кожи с помощью этого лечения. Различные другие процедуры, включая химический пилинг и дермабразию, аналогичным образом считаются полезными для профилактического лечения актинически поврежденной кожи.

Однако в литературе также есть сообщения, которые предполагают, что абляционная лазерная шлифовка может быть не особенно эффективной для лечения предраковых или злокачественных поражений, связанных с актиническими повреждениями. Например, Fulton et al описали довольно частое (14,3%) развитие актинических кератозов или базальноклеточных карцином в течение 1 года у 35 пациентов, подвергшихся шлифовке с помощью CO2-лазера.

Учитывая, что значение шлифовки с помощью CO2-лазера в качестве профилактики развития актинических кератозов и кожных карцином остается спорным, мы стремились получить объективные количественные доказательства, подтверждающие эту потенциальную роль процедуры. Эль-Домиати и соавторы недавно сообщили о подобном подходе к изучению эффектов терапии третиноином, поверхностного химического пилинга и дермабразии на иммуноокрашивание p53. В нашем исследовании наблюдалось последовательное снижение количества p53-положительных клеток в межфолликулярном эпидермисе по сравнению с исходным уровнем в фотоповрежденной коже, обработанной лазером. Это сохранялось в течение как минимум 6 месяцев после однократной 2-проходной процедуры шлифовки с помощью CO2-лазера. Было продемонстрировано, что мутации p53 обычно приводят к иммунопозитивности. В той степени, в которой иммуноокрашивание p53 является надежным индикатором мутаций в гене p53, уменьшенное количество кератиноцитов с аномальной экспрессией p53 должно, как отмечалось выше, снизить риск неопластических заболеваний, прогрессирующих в рак кожи, потому что с помощью процедуры были удалены клетки, по крайней мере, с 1 ранее обнаруживаемым генетическим поражением.

Кроме того, была описана повышенная экспрессия положительно окрашивающего p53 дикого типа в коже, подвергшейся воздействию солнца, и она связана со снижением клеточного апоптоза. Мы предполагаем, что это также может указывать на предраковое состояние и / или служить маркером хронического фотоповреждения. Таким образом, устранение даже избыточной экспрессии р53 дикого типа (определяемой иммунопозитивностью) может иметь некоторые профилактические преимущества. В этом пилотном исследовании p53-положительные кератиноциты были обнаружены как сгруппированные (предполагая мутантный p53), так и более диффузно разбросанные по межфолликулярному эпидермису (предполагая p53 дикого типа) перед лазерной шлифовкой. Окрашивание как в кластерных, так и в диффузных структурах было почти устранено обработкой. Удаление сгруппированных клонов р53-мутантных кератиноцитов явно свидетельствует о некоторой профилактической пользе, но влияние уменьшения количества клеток, сверхэкспрессирующих р53 дикого типа, менее очевидно.

Следует отметить, что острое воздействие ультрафиолетового излучения может временно увеличить экспрессию положительно окрашивающего p53 дикого типа. Чтобы свести к минимуму такие острые эффекты, мы попросили субъектов избегать пребывания на солнце как до шлифовки, так и в период реэпителизации после лечения. Хотя такое резкое пребывание на солнце не повлияет на демонстрацию мутантного p53, возможно, что некоторая часть экспрессии p53, обнаруженная до шлифовки (особенно в некластеризованных клетках), могла быть связана с недавним пребыванием на солнце и, следовательно, может быть p53 дикого типа. Преимущества устранения такой индуцированной солнечным светом экспрессии р53 дикого типа в настоящее время снова не ясны.

Потенциальный профилактический эффект шлифовки с помощью CO2-лазера, вероятно, будет еще более значительным, если эта процедура разрушит предраковые эпидермальные стволовые клетки. В литературе существуют разногласия относительно того, находятся ли эти клетки в межфолликулярном базальном слое, исключительно в области выпуклости волосяного фолликула или в обоих местах. Мы не можем комментировать способность терапии лазером CO2 воздействовать на фолликулярные стволовые клетки. Однако, поскольку некоторые стволовые клетки, вероятно, находятся в межфолликулярном эпидермисе, мы можем предположить, что лечение устраняет некоторые стволовые клетки с мутацией p53, учитывая практически полную потерю окрашивающих p53 клеток после лечения. Это согласуется с недавней работой Урато и др., которые проанализировали ДНК, полученную из предполагаемых колоний эпидермальных стволовых клеток, на наличие мутаций в экзоне 7 гена p53 в актинически поврежденной коже лица пациентов, подвергшихся шлифовке с помощью CO2-лазера. В этом исследовании среди всех 8 субъектов, имевших такие мутации на начальном этапе, ни у одного не было выявлено мутаций р53 экзона 7 после процедуры. Было высказано предположение, что после удаления фотоповрежденных межфолликулярных стволовых клеток с помощью лазерной шлифовки реэпителизация из фотозащищенных стволовых клеток, полученных из волосяных фолликулов, привела к результатам, отмеченным Urato et al.

Заказать услугу

    ×
    Оставить отзыв
    ×
    Задать вопрос

      ×
      Заказать звонок

        Обратный звонок

        Оставте заявку и мы перезвоним вам

        ×
        Фото консультация

          ×
          Оставить отзыв

            Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

            ×